Poly(A)及Poly(A)+全长转录组研究有哪些新思路？高分文章这样做！
关于mRNA和Poly(A)，人们往往都知道：真核生物mRNA表达包括转录、修饰、加工、核质转运和翻译步骤。初级转录mRNA经5’端加帽，3’端聚腺苷酸化形成Poly(A)尾和RNA剪接后成为成熟mRNA。其中Poly(A)尾对mRNA的出核、稳定性和翻译过程起至关重要的作用。并且，在真核体细胞中，大多数细胞质mRNA的Poly(A)尾巴会随着时间的推移通过去腺苷酸化而缩短,导致翻译效率的降低及降解的增加。
但有趣的是，在特定细胞类型（包括卵母细胞、早期胚胎和神经元）中，mRNA的Poly(A)尾巴也可以通过聚腺苷酸化的方式进行延长。例如，在成熟卵母细胞中，尽管mRNA具有较短的Poly(A)尾巴（<20 nt），但它们是稳定的并储存在核糖核蛋白（RNP）颗粒中而不被翻译，受精后不久，这些母源转录本在细胞质被聚腺苷酸化重新激活，将Poly(A)尾巴延长至大约80~150 nt，随后进行翻译以产生对胚胎存活和生长至关重要的蛋白质，如此长的翻译延迟的生理意义在于合子基因组激活之前的受精后发育需要许多蛋白质，这些蛋白质必须使用预转录和储存的母源转录本合成。
同样，神经元中翻译抑制的mRNA往往具有较短的 Poly(A)尾巴。一旦它们到达突触连接处，这些转录本就会在细胞质进行聚腺苷酸化以延长它们的Poly(A) 尾，从而进行有效及时的翻译。
除了卵母细胞及神经元，单倍体雄性生殖细胞(精子细胞)的精子发生过程也表现出非偶联的转录和翻译的生理过程，是研究转录和翻译解偶联机制的优秀体内模型。
下面，我们将从一篇文章带您详细了解Poly(A)长度控制对精子发生过程中转录与翻译的调控作用：
经典文章
文章题目：Uncoupling transcription and translation through miRNA-dependent poly(A) length control in haploid male germ cells
发表期刊：Development
影响因子：6.862
发表单位：华大基因、南通大学生殖医学研究院、内华达大学医学院
01
研究背景
在精子细胞演变为精子的过程中，随着精子细胞变形和细胞核的压缩，基因转录活动将逐渐降低直至完全停止，那些为精子细胞后期阶段发育所需的基因都需要提前转录为信使核糖核酸（mRNA），然后以翻译抑制状态储存在精子细胞中，直到特定发育阶段再被激活翻译，以合成蛋白质发挥作用。这就是精子形成过程中经典的“转录-翻译解偶联”现象，那么这些转录完成的mRNA是如何进入翻译抑制状态并保持稳定状态呢？这一直是生物生殖学中的一个不解之谜。然而，由于测序技术的局限性，测量Poly(A)全长序列一直困难重重。本文巧妙利用PacBio平台的ZMW测序原理能够准确测定同质核苷酸的优势，开发了测量全长转录本及全长Poly(A)的测序技术，并进一步探讨了精子发育过程中，Poly(A)长度的动态变化。
02
主要研究结果
为探究精子细胞分化过程中Poly(A)长度动态变化与mRNA稳定性和翻译延迟的关系，作者通过构建PAPA-seq文库，使用Poly(U)聚合酶将G、I核苷酸加入到mRNA的3′端，并进行反转录生成含有全长Poly(A)尾的cDNA，使用PacBio平台测序检测精子发生过程中粗线期精母细胞（pachytene spermatocytes）、圆形（round）和长形精子细胞（elongating spermatids）以及精子的Poly(A)长度及3‘UTR长度变化（如图1）。
PAPA-seq结果显示，当粗线期精母细胞发育成圆形和长形精子细胞时，转录本全长呈缩短趋势，且mRNAs的3‘UTRs及5‘UTRs逐渐缩短。但Poly(A)长度则呈双相方式动态变化，从粗线期精母细胞到圆形精子细胞，Poly(A)尾长度逐渐增加，这可能有助于延长mRNA半衰期，并在精子发生后期保护mRNAs以延迟翻译。相反，从圆形精子到长形精子过程中，Poly(A)的长度逐渐变短，表明转录本 Poly(A)长度变化与精子发生过程中的翻译延迟同步。
图1 Poly(A)全长转录组深度测序显示精子发生过程中的Poly(A)长度动态变化
为了进一步探讨Poly(A)长度对mRNA翻译抑制和激活的影响，研究团队通过PAPA-seq，发现定位在RNP的mRNAs的平均Poly(A)长度仅为定位在含多核糖体中（polysome）mRNA的1/40，这表明mRNA的去腺苷酸化与其在RNPs的定位之间存在强烈的关联。通过分析RNP和polysome中的miRNA-mRNA靶向关系发现，在粗线期精母细胞中，与polysome转录本相比，RNP富集型转录本中的miRNA靶点更集中在3‘端，精子发生进展到圆形和长形精子细胞阶段时，目标转录本3‘UTRs上的miRNA靶点逐渐减少并最终消失，这与长形精子细胞中RNP的mRNAs释放相一致，表明miRNAs驱动mRNAs进入RNPs进行去腺苷酸化。具有较长的Poly(A)尾(>50nt)的转录本从RNP组分转移到polysome组分，而具有较短的Poly(A)尾(<5nt)的转录本往往被隔离在核糖核蛋白(RNP)颗粒中，以进行翻译抑制并保持稳定。
并且，通过Drosha条件敲除(cKO)小鼠模型及miR-506基因敲除(KO)小鼠系实验以消除miRNA的产生，验证miRNA通过去腺苷酸化缩短其靶mRNA的Poly(A)长度，从而将它们隔离在RNP颗粒中以延迟翻译。
图2 miRNA缺失对RNP颗粒和多核糖体组分中Poly(A)长度分布的影响
03
科技君点睛
上述文章中，作者开发了一种基于PacBio测序的Poly(A)全长转录组测序，相对于基于NGS短读长平台的Tail-Seq和PAL-Seq技术，可以更加准确的确定Poly(A)尾长度及序列。利用这种方法，测定了精子发生过程中精子细胞分化过程中Poly(A)长度的动态变化。此外，并发现miRNAs在Poly(A)长度的调节中起着重要作用，从而导致翻译延迟。
文章链接：https://doi.org/10.1242/dev.199573
华大可提供Poly(A)+全长转录组
利用Poly(A)+全长转录组独特建库方法，建库过程中反转录后得到全长的Poly(A)序列和全长mRNA，并在Pacbio Sequel II平台上进行CCS测序，准确检测Poly(A)长度和异质碱基类型，研究Poly(A)在基因表达调控中的作用。
Poly(A)+全长转录组特有信息分析内容
BGITech -
1. Poly(A)长度分布
图3 测序数据的Poly(A)长度分布
2. Poly(A)长度与转录本表达量的关系
图4 Poly(A)长度与转录本表达量关系图
3. Poly(A)长度与转录本编码能力关系图
图5 Poly(A)长度与转录本编码能力关系图
4. 非A碱基分布情况
图6 全长Poly(A)非A碱基含量图
Poly(A)+全长转录组产品优势
BGITech -
1. 测一得二：
Poly(A)+全长转录组测序除了全长mRNA序列还可以得到全长Poly(A)序列，加量不加价；
2. 可得到全长的Poly(A)信息：
Poly(A)长度从几十到几百个碱基不等；基于短读长平台的Poly(A)测序由于读长限制最长仅能检测230nt左右的Poly(A)序列；且短读长平台只能检测Poly(A)尾及3’端的一部分RNA信息，无法从RNA整体水平上研究Poly(A)长度与isoform及非编码区的关系；
3. Poly(A)长度和碱基检测结果准确度高：
Poly(A)+全长转录组基于Sequel II平台CCS测序，可直接测序得到全长的Poly(A)长度和碱基信息，准确度高；
4. 样本量要求低：
Poly(A)+全长转录组样本要求和常规全长转录组一致，起始样本量可低至1μg总RNA；ONT直接RNA测序对样本量要求很高，需要约25μg总RNA（500ng mRNA）。
供稿：永远在科研的小橙
编辑：市场部
近期热文
了解更多产品服务及资讯，关注我们！